Einkaufsführer PCR-Technologie
Die Polymerase-Kettenreaktionstechnologie (PCR) ist ein fester Bestandteil unzähliger Forschungs- und Testlabors in einer Reihe von Bereichen, darunter Biomedizin, klinische Diagnostik, Lebensmittelmikrobiologie und kriminelle Forensik. Diese grundlegende Technologie verwendet thermische Zyklen, um eine Reihe von Reaktionen zu ermöglichen, bei denen eine DNA-Probe schnell und exponentiell repliziert wird, um Millionen oder Milliarden von Sequenzkopien zu produzieren. Bei der Anschaffung eines neuen PCR-Systems ist es wichtig, die Endziele Ihrer Anwendung, die Genauigkeit und Effizienz der Thermocycling-Ausrüstung sowie die Kapazität und Flexibilität des Instruments zu berücksichtigen. Dieser Artikel gibt einen Überblick über verschiedene Optionen und Funktionen, die für PCR-Systeme verfügbar sind, um Ihnen dabei zu helfen, ein geeignetes System für Ihre Anwendung einzugrenzen.
1. PCR vs. qPCR vs. dPCR
Während alle PCR-Systeme DNA unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion replizieren, gibt es unterschiedliche Methoden, die von verschiedenen Systemen verwendet werden, um spezifische Ergebnisse zu erzielen. Zu diesen unterschiedlichen Methoden gehören die Standard-PCR, die quantitative PCR (qPCR) und die digitale PCR (dPCR).
Standard-PCR-Maschinen werden typischerweise verwendet, um DNA für weitere nachgelagerte Tests und Verwendungen zu amplifizieren; In gewisser Weise wird diese Technologie eher als Mittel zur Erzeugung eines Endprodukts als als analytische Testmethode selbst verwendet. Die amplifizierte DNA kann nur nach Abschluss der PCR-Reaktion und nicht in Echtzeit gemessen werden, weshalb dieses Verfahren manchmal als Endpunkt-PCR bezeichnet wird. Das Endprodukt der traditionellen PCR-Amplifikation wird üblicherweise für die nachgelagerte Klonierung und Sequenzierung verwendet und kann auch mit Gelelektrophorese überprüft werden, um das Vorhandensein von Zielsequenzen und ihre relative Menge bei niedriger Auflösung (basierend auf der Bandenintensität) zu bestätigen.
Für eine schnellere und genauere Quantifizierung der in einer Probe vorhandenen Menge an Zielsequenz verwendet die quantitative PCR (qPCR), auch als Real-Time-PCR bekannt, fluoreszierende Sonden während des Amplifikationsprozesses, um die Menge an DNA zu überwachen, die nach jedem thermischen Zyklus vorhanden ist. Indem beobachtet wird, wie viele Zyklen erforderlich sind, um einen bestimmten Schwellenwert der Fluoreszenzintensität zu erreichen, kann der Analytiker die DNA-Menge im Ausgangsmaterial bestimmen, wenn er die Ergebnisse mit einer Standardkurve vergleicht. qPCR kann auch das Vorhandensein oder Fehlen einer Zielsequenz schneller bestätigen als die Endpunkt-PCR und wird daher in diagnostischen Anwendungen wie dem Nachweis von SARS-CoV-2 verwendet (unter Verwendung von reverser Transkription, um zuerst virale RNA in cDNA umzuwandeln).
Die digitale PCR (dPCR) ist eine weitere quantitative Methode, bei der PCR-Reaktionen in Tausenden von separaten Reaktionskammern stattfinden und die absolute Anzahl der DNA-Moleküle in der ursprünglichen Probe anhand der Anzahl der Reaktionskammern bestimmt werden kann, die nach Abschluss der Amplifikation ein Fluoreszenzsignal ergeben . Anders als bei qPCR werden Fluoreszenzmessungen nicht in Echtzeit durchgeführt und es wird keine Standardkurve benötigt, um die DNA in der Probe zu quantifizieren. Während dPCR typischerweise mit einem begrenzten Durchsatz und höheren Kosten als qPCR verbunden ist, ist es präziser, empfindlicher und genauer bei der Quantifizierung von DNA und ist besonders nützlich in Anwendungen wie dem Nachweis seltener Mutationen und Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs).
Die Entscheidung, ob eine Endpunkt-PCR (qualitativ/semiquantitativ) oder eine quantitative Methode (qPCR oder dPCR) gewählt werden soll, ist relativ einfach, wenn Sie Ihre Anwendung in Betracht ziehen, aber die Wahl zwischen qPCR und dPCR kann nuancierter sein. qPCR ist für viele Anwendungen hochdurchsatzfähig, kostengünstig und ausreichend empfindlich, aber dPCR kann die bessere Wahl sein, wenn eine absolute Quantifizierung mit niedrigen Nachweisgrenzen im Vordergrund steht.
2. Die Bedeutung der Temperaturkontrolle
Die Fähigkeit von Thermocyclern, die Temperatur von Proben genau und effizient einzustellen und zu kontrollieren, ermöglicht den Erfolg von Amplifikationsreaktionen und sollte bei der Auswahl eines PCR-Systems im Mittelpunkt stehen. Unterschiedliche Systeme können unterschiedliche Fähigkeiten in Bezug auf Rampenraten, Temperaturgleichmäßigkeit und -genauigkeit sowie die Fähigkeit bieten, Temperaturgradienten über Thermoblöcke hinweg zu erreichen, um die Optimierung von PCR-Verfahren zu unterstützen.
Die Rampenrate bezieht sich auf die Geschwindigkeit der Temperaturänderungen zwischen Temperaturwechselschritten und wird in den Gerätespezifikationen typischerweise in Grad Celsius pro Sekunde (°C/s) ausgedrückt. Hersteller können Informationen zu maximalen Rampenraten und durchschnittlichen Rampenraten bereitstellen sowie zwischen Anstiegsraten (Heizen) und Abwärtsrampen (Kühlen) eines Instruments unterscheiden. Im Allgemeinen entsprechen höhere Rampenraten schnelleren Laufzeiten, aber Käufer sollten sich davor hüten, sich auf maximale Rampenraten zu konzentrieren, ohne andere Metriken im Zusammenhang mit der Instrumentengeschwindigkeit zu untersuchen. Ein Instrument erreicht möglicherweise nur für kurze Zeit seine höchste Anstiegsrate, und die durchschnittliche Anstiegsrate spiegelt das Tempo der Temperaturänderungen besser wider. Während die Rampenratenspezifikationen eine allgemeine Vorstellung davon geben können, wie schnell bestimmte Instrumente laufen können, wenn möglich,
Temperaturgenauigkeit und -einheitlichkeit sind ebenfalls Schlüsselfaktoren für erfolgreiche Reaktionen, und obwohl alle Thermocycler darauf ausgelegt sind, die für die PCR erforderlichen Temperaturen zu erzeugen, können bestimmte Merkmale ein höheres Maß an Vertrauen bieten, was für Anwendungen von entscheidender Bedeutung ist, bei denen die Proben möglicherweise begrenzt sind und zuverlässige Ergebnisse vorliegen von größter Bedeutung, etwa in der klinischen Diagnostik und Forensik. Eine präzise Temperaturkontrolle ist auch entscheidend, wenn das PCR-Gerät für empfindliche Techniken wie die hochauflösende Schmelzanalyse (HRM) verwendet wird. Ein beheizter Deckel kann eine bessere Temperaturgleichmäßigkeit im gesamten PCR-Röhrchen gewährleisten, da die Probe ohne beheizten Deckel verdunsten und an der Oberseite des Röhrchens kondensieren kann, wo die Temperatur kühler ist. Das Thermoblock-Design wirkt sich auch auf die Temperaturregelung aus; Aluminiumblöcke sind die wirtschaftlichste Option, aber am wenigsten leitfähig, Dies bedeutet, dass sie langsamer eine Temperaturgleichförmigkeit erreichen und niedrigere Anstiegsraten aufweisen als leitfähigere Blöcke. Silber- und goldbeschichtete Blöcke sind teurer, ermöglichen jedoch eine schnellere Wärmeübertragung und gewährleisten eine gleichmäßige Temperaturverteilung über den Block.
Unterschiedliche DNA-Ziele können unterschiedliche Temperaturen erfordern, um die besten Amplifikationsergebnisse zu erzielen; Beispielsweise benötigen GC-reiche Sequenzen höhere Temperaturen zur Denaturierung. Die idealen Annealing-Temperaturen werden auch von einer Reihe von Faktoren beeinflusst – während die Temperaturen für diesen Schritt normalerweise basierend auf den Schmelztemperaturen der Primer ausgewählt werden, können Unterschiede in den Schmelztemperaturen zwischen Primerpaaren und der Einfluss von Reagenzienkonzentration, pH-Wert und Salzkonzentration allesamt sein machen die Optimierung der Reaktionstemperaturbedingungen zu einer komplizierten Aufgabe.PCR-Maschinen mit Temperaturgradientenfähigkeiten sind so konzipiert, dass sie die Optimierung von PCR-Methoden unterstützen, indem sie das Testen mehrerer Annealing-Temperaturen in einem einzigen Lauf ermöglichen. Je nach Art und Vielfalt der Proben, die Sie mit Ihrem PCR-Gerät analysieren möchten,
3. Thermische Blöcke
Wie bereits erwähnt, kann der Thermoblock, der mit einem PCR-Instrument verwendet wird, einen Unterschied bei der Temperaturregelung bewirken, aber das Design des Blocks – und das Design des Instruments, um verschiedene Blöcke aufzunehmen – wirkt sich auch auf den Durchsatz, die Kosten für Verbrauchsmaterialien und die Flexibilität aus. Typische Blöcke sind in einem 96-Well- oder 384-Well-Format erhältlich, obwohl auch andere Formate wie 48-Well und 1536-Well erhältlich sind. Eine höhere Well-Anzahl ermöglicht einen höheren Durchsatz bei geringeren Reaktionsvolumina, was zunächst teurer ist, aber letztendlich den Preis pro Reaktion aufgrund des geringeren Reagenzvolumens senkt, das für jede Vertiefung verwendet wird. Wenn Sie bedenken, wie viele Proben Sie verarbeiten und wie oft Sie das Gerät verwenden, wird berücksichtigt, ob ein Thermoblock mit niedrigerer oder höherer Well-Count-Zahl für Ihr Labor am praktischsten und kostengünstigsten ist.
Einige Instrumente werden mit einem festen Blockformat geliefert, während andere die Verwendung austauschbarer Blöcke ermöglichen, was mehr Flexibilität bietet, um zwischen 96- und 384-Well-Formaten oder zwischen verschiedenen Blockmaterialien für verschiedene Anwendungen zu wechseln. Einige Thermocycler nehmen auch mehrere Blöcke im selben Gerät auf, sodass verschiedene Protokolle gleichzeitig mit verschiedenen Probensätzen durchgeführt werden können.3 Blöcke mit „universellen“ Abmessungen erhöhen die Flexibilität weiter, um je nach Bedarf Röhrchen, Streifen oder PCR-Platten unterschiedlicher Größe zu verwenden .
Aufgrund der Schlüsselrolle dieser Komponente bei Temperaturregelung, Probenhandhabung und Durchsatz sollten die Thermoblockoptionen bei der Auswahl eines Thermocyclers sorgfältig geprüft werden. Für Labore mit einem geringen Probenvolumen oder solchen, die routinemäßig nur eine Handvoll Assays durchführen, können kostengünstigere Instrumente mit festen Blöcken und einem Standardformat mit 96 Vertiefungen ausreichen. Modulare, flexible Instrumente können jedoch für Labore mit einer größeren Anzahl von Protokollen, unterschiedlichen Probenvolumina und mehr Benutzern, die sich für ihre eigenen Assays auf dasselbe Instrument verlassen, sowie für Labore, die ihre Durchsatzkapazität in Zukunft erweitern möchten, von Vorteil sein.